快速检测血液中苯二氮卓类药物及毒品成分

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所属分类:头发测毒知识
摘要

该种方法其实也是检测头发中是否有毒品成分的技术,当然也可以检测酒水饮料是否含有毒品。

快速检测血液中苯二氮卓类药物及毒品成分

苯二氮类药物(BZDS),是临床常用的镇静催眠药。过量使用该类药物时,患者可由轻度的镇静催眠发展至昏迷甚至死亡。临床上,滥用BZDS或使用该类药物轻生的病例十分常见。

BZDS中毒患者入院后,通常已经昏迷,临床医生难以判断中毒类型。因此,需采用快速、准确的定性检测方法,对BZDS中毒患者进行确诊。确诊后,临床医生多会采用血液净化的方式清除BZDS,通过定量检测血液中BZDS的浓度可有效评估血液净化前后的治疗效果。

目前已报道的BZDS血药浓度检测方法存在多种局限性:仅能检测某一种药物,前处理方法较为复杂,检测周期长,检测范围不能同时覆盖所有BZDS的治疗或中毒浓度范围,难以满足临床上快速、简便、准确的检测需求。

本文在已有文献及相关司法毒物检测国标的基础上,建立一种快速高效地定性定量检测人血浆中7种常见BZDS的方法,以期为临床中毒检测及司法毒物鉴定提供参考。

WaterS XeVo tQD IVD液质联用仪(eSI源)、tHermo SCIentIfIC LegenD mICro 21r冷冻高速离心机(离心半径:8.6cm)、密理博DIreCt 8超纯水系统、梅特勒mS105十万分之一天平、tHer-mo SCIentIfIC涡旋仪、tHermo SCIentIfIC mySPIn 6台式离心机(离心半径:5cm)、BenCHtoPCLeanerS超声仪、艾本德移液枪(10、100、200、1000μL)。

快速检测血液中苯二氮卓类药物及毒品成分

药品与试剂。地西泮对照品(纯度99.9%,批号171225-201304)、氯硝西泮对照品(纯度99.7%,批号171227-201404)、咪达唑仑对照品(纯度99.8%,批号171265-201402)、硝西泮对照品(纯度99.9%,批号171217-201403)、三唑仑对照品(纯度99.6%,批号171230-201203)、阿普唑仑对照品(纯度99.5%,批号171218-201305)、劳拉西泮对照品(纯度99.2%,批号171253-201102)均购自中国食品药品检定研究院;甲酸(LC-mS级,批号a117-50)、乙腈(LC-mS级,批号a955-4)、甲醇(LC-mS级,批号a456-4)均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他化学试剂均为分析纯;所有实验用水均由密理博DIreCt 8超纯水系统制备;健康人空白血浆由天津医科大学总医院血库提供。

储备液和工作液的制备。分别精密称取7种BZDS对照品各25mg分置于7个25mL量瓶中,各加入甲醇定容,制备成质量浓度为1.0mg·mL-1的标准储备液,于-80摄氏度冰箱保存备用。精密量取上述各储备液适量,置于同一25mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,获得混合对照品工作液(7种药物的质量浓度分别为:劳拉西泮40000ng·mL-1、硝西泮40000ng·mL-1、阿普唑仑20000ng·mL-1、咪达唑仑40000ng·mL-1、三唑仑4000ng·mL-1、氯硝西泮40000ng·mL-1、地西泮400000ng·mL-1)。

质控品的制备。用空白血浆逐级稀释混合对照品工作液,制得高、中、低3种浓度(以地西泮为例:6670ng·mL-1、2220ng·mL-1、740ng·mL-1)的血浆质控样品。

血浆样本处理。精密量取血浆样品100μL,置于1.5mLeP管中,加入乙腈500μL,涡旋混合5分钟,于4摄氏度、14000r·min-1离心5min,取上清液进样分析。

色谱条件。色谱柱:WaterS BeHC18柱(1.7μm,2.1mm×50mm);流动相:含0.01%甲酸乙腈溶液-0.01%甲酸水溶液(0-3mIn,10:90→40:60;3-4mIn,40:60→90:10;4-5mIn,90:10→10:90);流速:0.4mL·min-1;柱温:40摄氏度;进样室温度:15摄氏度;进样量:2μL。

质谱条件。离子源为电喷雾电离源(eSI源),毛细管电压为0.6kV,脱溶剂气温度为300摄氏度,脱溶剂气流速为800L·H-1,蠕动泵以10μL·min-1流速向离子源中持续泵入10000ng·mL-1对照品的甲醇溶液,对锥孔电压和碰撞能量进行优化后,检测方法采用多反应监测模式,正离子模式分通道扫描,丰度最高的子离子1用于定性定量,子离子2用于定性。

稳定性。分别考察血浆样品室温放置12小时、4摄氏度放置24小时、反复冻融3次、-20摄氏度放置1个月、提取处理后进样器(15摄氏度)放置24小时的稳定性。结果表明,血浆样品室温放置12小时稳定(相对误差均在±10%之内),4摄氏度放置24小时稳定(相对误差均在±7.0%之内),反复冻融3次稳定(相对误差均在±10%之内),-20摄氏度放置1个月稳定(相对误差均在±1%之内),提取处理后进样器(15摄氏度)放置24小时稳定(相对误差均在±12%之内)。

快速检测血液中苯二氮卓类药物及毒品成分

临床应用实例

下对病例2使用本方法如何协助医师开展BZDS中毒诊治工作进行介绍。

病例2:某52岁女性患者,具有抑郁症史和失眠史,就诊前一天出现意识不清,紧急送诊于外院,行洗胃及补液治疗,尿液检出安定成分,给予氟马西尼拮抗治疗,未见好转。转入我院ICU后,患者已深度昏迷,无血压,自主呼吸消失。采血35分钟后,使用本方法检出阿普唑仑,质量浓度为2080ng·mL-1,临床据此结果在前述治疗的基础上,多次采用血液灌流清除毒物。入院第2日取血复检,阿普唑仑质量浓度为480ng·mL-1。第3日复查阿普唑仑质量浓度<200ng·mL-1,患者意识逐渐恢复。第6日,患者恢复自主呼吸。

检测方法的选择 关于生物样本中BZDS药物的检测方法,文献中多采用HPLC或UPLC、gC-mS、UPLC-mS/mS 3种手段。7种BZDS类药物极性相近,液相色谱图上很难做到基线分离,且BZDS药物为结构类似物,紫外吸收光谱相似,仅依靠保留时间和紫外光谱难以定性鉴别。gC-mS方法分离度高、定性鉴别能力强,但灵敏度受限(例如,硝西泮定量限在3000ng·mL-1左右,而中毒浓度为200ng·mL-1)。而UPLC-mS/mS检测速度快,定性鉴别能力强,灵敏度高,线性范围宽,可高效检测不同中毒浓度范围的各种BZDS药物。

样品处理方式、色谱条件的选择。多数BZDS中毒患者送诊时病情凶险,需快速确定中毒类型及程度,以辅助临床治疗,因此需尽量缩短样品处理及进样分析时间。文献中BZDS血浆样品的前处理方法较多,本文则采用了大比例的乙腈直接沉淀蛋白,低温超速离心后,直接进样分析。使用该方法沉淀蛋白后,对100个样本进行单批次分析,未发现对检测仪器及色谱柱柱效产生不良影响。本文采用梯度洗脱的条件,由大比例水相过渡至大比例有机相,在保证BZDS色谱峰基线分离及保留时间重复性的前提下(批内和批间的保留时间rSD均小于3%),尽可能压缩洗脱时间。采用上述样品处理方式及色谱条件后,可将一批次样本的分析时间缩短至35分钟左右,为临床上诊断救治提供了宝贵的时间。

定性分析。定性分析通常采用不同化学原理进行筛选分析和确证分析。本文采用色谱峰保留时间和质谱离子相对丰度比结合的方法。筛选分析采用母离子/子离子1,若目标样品的色谱峰保留时间与阳性对照的色谱峰保留时间比较,相对误差小于2.5%,可初步确证目标样本存在该种药物。确证分析选取两对母离子/子离子,如果检出的色谱峰保留时间与质控样品的色谱峰保留时间比较,相对误差小于2.5%,并且在扣除背景后的样品质谱图中均出现所选择的离子对,而且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过规定范围,则可判断样品中存在这种药物。

线性范围及质控浓度的确定。尽管BZDS药物化学结构类似,但其中毒浓度范围差异较大,以地西泮和三唑仑为例,地西泮中毒浓度范围为3000-20000ng·mL-1,三唑仑中毒浓度范围仅为10-40ng·mL-1,而文献中多采用相同或相近的线性范围及质控浓度,不能覆盖BZDS药物的检测区间,难以满足临床实际检测需求。本文针对7种BZDS药物,设计了不同的线性浓度范围及质控样品,可满足临床上差异化的检测需求。

病例分析。本文中的案例2,尽管患者尿液中检出安定成分,但仍无法确定为何种药物中毒及中毒浓度。转入我院后,采用本文的检测方法,在1小时内检出了阿普唑仑及中毒浓度,为临床节省了宝贵的抢救时间。连续3天的阿普唑仑浓度测定,为临床评估血液灌流的清除效率提供了准确的检测数据。

综上,本文建立并验证了一种同时检测人血浆中7种常见苯二氮类药物的方法。该方法检测速度快、专属性高、重复性好,定性能力强,可有效检测治疗及中毒浓度范围的7种苯二氮类药物。此外,经临床实践证明,本方法可有效评价血液净化的清除效率,对处于不同治疗阶段的中毒患者,均具有重要的临床指导意义。

中国医院药学杂志2019年

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